Von Jon Fleetwood
Mithilfe der „No See’m“-Technik gelang es Baric und seinen Kollegen, alle sichtbaren Spuren der Genom-Assemblierung im Labor aus dem fertigen Coronavirus-Genom zu entfernen.
In einem 2008 erschienenen Methodenkapitel aus dem Labor von Ralph Baric wurde das vollständige Protokoll für die digitale Konstruktion von Coronavirus-Genomen in voller Länge am Computer offen veröffentlicht, wonach diese physisch zu einer endgültigen Genomsequenz zusammengesetzt wurden, wobei alle sichtbaren Spuren der gentechnischen Manipulation aus dieser Sequenz entfernt wurden.
Das Kapitel mit dem Titel „Systematic Assembly and Genetic Manipulation of the Mouse Hepatitis Virus A59 Genome“ wurde von Eric F. Donaldson, Amy C. Sims und Ralph S. Baric verfasst und in Methods in Molecular Biology veröffentlicht, einer Buchreihe von Springer/Humana Press, die Laborprotokolle enthält.
Download 978 1 59745 181 9 Kapitel 21, 707 KB ∙ PDF-Datei
Das Herzstück des Systems ist die „No See’m“-Technik.
Baric hatte diese Technik bereits 2006 in einer Veröffentlichung wie folgt beschrieben:
„No-See’m-Stellen können genutzt werden, um fremde Gene in virale, eukaryotische oder mikrobielle Genome oder Vektoren einzufügen und gleichzeitig alle Spuren der Restriktionsstellen zu entfernen, die bei der Manipulation der rekombinanten DNA verwendet wurden.“
In dem Kapitel aus dem Jahr 2008 erläutern die Autoren, wie dies in der Praxis bei Coronaviren funktioniert:
„Wir haben eine DNA-Assemblierungsplattform entwickelt, die die unspezifischen, hochvariablen Sequenzsignaturen von Typ-IIs-Restriktionsenzymen nutzt, um einen molekularen Klon in voller Länge des murinen Hepatitis-Coronavirus (MHV) vom Stamm A59 zusammenzusetzen. Der Ansatz ermöglicht es zudem, Veränderungen in ein DNA-Fragment einzubauen, indem Primer entworfen werden, die die Restriktionsstelle und die gewünschten Mutationen enthalten. Durch Hinzufügen der Typ-IIs-Restriktionsstelle in der richtigen Ausrichtung entfernt die anschließende Verdauung die Restriktionsstelle und hinterlässt ein klebriges Ende, das die gewünschte Mutation enthält und bereit ist, an ein zweites, parallel als sein Komplement erzeugtes Fragment ligiert zu werden. In diesem Kapitel erörtern wir die Details der Methode zur Assemblierung eines infektiösen Klons des MHV in voller Länge und zur anschließenden Einfügung einer spezifischen Mutation in den Klon, um die Leistungsfähigkeit dieses einzigartigen ortsspezifischen ‚No See’m‘-Mutageneseansatzes zu demonstrieren.“
Sie teilten das Coronavirus-Genom in sieben modulare cDNA-Fragmente auf.
Mithilfe computergestützter Primer bauten sie temporäre Typ-IIs-Restriktionsstellen in jedes Fragment ein.
Nach dem Verdau wurden diese Stellen vollständig entfernt.
Die resultierenden narbenfreien klebrigen Enden wurden miteinander ligiert, um eine cDNA in voller Länge zu bilden, die nur die exakte Sequenz enthielt, die die Forscher am Computer programmiert hatten – ohne übrig gebliebene Restriktionsstellen, Linker oder andere Labormarkierungen.
Ohne die „No See’m“-Technik hätte das endgültig zusammengesetzte Genom angeblich offensichtliche Labor-Spuren aufgewiesen: zusätzliche Restriktionsenzymstellen an jeder Verbindungsstelle, Linker-Sequenzen, duplizierte Motive und andere künstliche Klonierungsspuren, die sofort verraten hätten, dass das Genom in einem Labor ausgeschnitten und wieder zusammengefügt worden war.
In der Veröffentlichung heißt es, die Plattform sei bereits einsatzbereit und weit verbreitet:
„Weit über hundert Mutanten wurden mithilfe dieses Ansatzes in den MHV-Klon eingebaut, was die Zahl aller anderen bisher beschriebenen reversen genetischen Systeme für Coronaviren bei weitem übersteigt. Darüber hinaus wurde diese Technologie genutzt, um Reagenzien als Reaktion auf neu identifizierte, aufkommende Coronaviren rasch zu entwickeln.“
Bereits 2008 hatte Barics Labor das präzise molekulare Gerüst veröffentlicht, das zur Erstellung computergestützter, spurloser Coronavirus-Genome erforderlich ist – endgültige Sequenzen, die so gestaltet werden konnten, dass sie wie ein natürlich zirkulierender Stamm aussahen.
Könnte das von Ralph Barics Labor 2008 veröffentlichte, völlig spurlose „No See’m“-Genom-Engineering-Gerüst – die Fähigkeit, Coronavirus-Genome in voller Länge digital zu entwerfen und physisch zusammenzusetzen, während gleichzeitig jede Laborsignatur vollständig aus der endgültigen Sequenz gelöscht wird – erklären, warum der wahre Ursprung von SARS-CoV-2 trotz jahrelanger intensiver internationaler Untersuchungen nach wie vor ungeklärt bleibt?
