Von Jon Fleetwood
Ein vom NIH finanziertes Projekt beschreibt, wie vollständige Coronavirus-Genome digital zusammengesetzt, bearbeitet und rekonstruiert werden können, wobei sichtbare Spuren der genetischen Manipulation aus der endgültigen Sequenz entfernt werden.
Im November 2002 – demselben Monat, in dem laut späterer Aussage chinesischer Behörden die ersten SARS-Fälle in der Provinz Guangdong auftraten – veröffentlichte ein Team unter der Leitung des Coronavirologen Ralph Baric von der University of North Carolina eine Arbeit, in der ein programmierbares System zur Assemblierung von Coronavirus-Genomen in voller Länge beschrieben wurde, das in der Lage ist, Coronavirus-Genome zu rekonstruieren und dabei sichtbare Spuren der Assemblierung aus dem endgültigen Konstrukt zu entfernen.
Die am 1. November 2002 im Journal of Virology veröffentlichte Arbeit trug den Titel „Systematic Assembly of a Full-Length Infectious cDNA of Mouse Hepatitis Virus Strain A59“ und beschrieb eine neue Plattform der reversen Genetik zur Assemblierung eines vollständigen Coronavirus-Genoms aus modularen DNA-Fragmenten.
Die Arbeit wurde durch amerikanische Steuergelder in Form von Forschungszuschüssen der National Institutes of Health (NIH) finanziert: „AI23946 und GM63228 an R.S.B., AI26603 an M.R.D. und AI17418 an S.R.W.“
Noch bevor der Ausbruch von SARS-CoV-1 erstmals gemeldet wurde, hatte Barics Arbeit aus dem Jahr 2002 bereits eine programmierbare Plattform für die Reverse-Genetik von Coronaviren etabliert, die in der Lage war, Genom-Assemblierungen modular durchzuführen, nahtlose, narbenfreie Rekonstruktionen vorzunehmen, gezielte genetische Manipulationen durchzuführen und angeblich infektiöses Coronavirus-Material aus künstlich hergestellten genetischen Sequenzen zu gewinnen.
Diese Systeme ermöglichten es Forschern, Coronaviren unter Laborbedingungen rasch zu entwerfen, zu modifizieren, zu rekonstruieren, zu testen, zu sequenzieren und in großem Maßstab zu untersuchen – Fähigkeiten, die später zunehmend mit Diagnostik, Impfstoffentwicklung, genomischer Überwachung, Forschung zur Pandemiebekämpfung und einer umfassenderen Infrastruktur zur Coronavirus-Vorsorge verknüpft wurden.
Der zeitliche Zusammenhang wirft offensichtliche Fragen darüber auf, ob die Entstehung hochentwickelter, staatlich geförderter Coronavirus-Engineering-Systeme und der Beginn der SARS-Ära wirklich unabhängige Ereignisse waren.
Die Studie konzentrierte sich auf das Maus-Hepatitis-Virus (MHV), ein Coronavirus der Gruppe II, doch in der Veröffentlichung wurde offen ein flexibles System zur Konstruktion und Rekonstruktion von Coronavirus-Genomen in voller Länge beschrieben.
„Es wurde eine neuartige Methode entwickelt, um eine infektiöse cDNA in voller Länge des Maus-Hepatitis-Virus-Stamms A59, einem Coronavirus der Gruppe II, zusammenzusetzen“, heißt es in der Veröffentlichung.
Die Forscher erklärten, dass sie das Coronavirus-Genom in sieben separate cDNA-Fragmente aufteilten, einzigartige Verbindungsstellen an den Enden der Fragmente konstruierten und dann das gesamte Genom zu einem Konstrukt in voller Länge wieder zusammensetzten.
„Die verbindenden Restriktionsstellen, die sich an den Enden jeder cDNA befinden, werden während der Assemblierung des vollständigen cDNA-Produkts in voller Länge systematisch entfernt, was eine Neuzusammensetzung ohne die Einführung von Nukleotidveränderungen ermöglicht“, heißt es in der Veröffentlichung.
Das bedeutet, dass die während der Konstruktion verwendeten künstlichen Assemblierungsmarker im endgültigen rekonstruierten Genom nicht sichtbar blieben.
Die Arbeit beschrieb dies als „No See’m“-Technologie: eine narbenfreie Assemblierungsmethode, die darauf ausgelegt ist, nach der Assemblierung die exakte Wildtyp-Virussequenz an den Verbindungsstellen wiederherzustellen.
Die Autoren erklärten das System wie folgt:
„Nach der Spaltung und Ligation mit dem angrenzenden Fragment gehen beide Esp3I-Schnittstellen im Endprodukt verloren, sodass an der Verbindungsstelle die exakte MHV-A59-Sequenz verbleibt.“
In der Studie heißt es weiter:
„Im zusammengesetzten Produkt sollten keine Spuren der Esp3I-Schnittstelle zurückbleiben, die in die einzelnen Klone eingebaut wurde.“
Die Veröffentlichung betonte zudem, dass die Plattform eine gezielte Manipulation des gesamten Coronavirus-Genoms ermögliche.
„Infektiöse Konstrukte von MHV-A59 in voller Länge werden genetische Modifikationen des gesamten Coronavirus-Genoms ermöglichen“, schrieben die Autoren.
Die Forscher erklärten zudem, dass die Methode über Coronaviren hinaus Anwendungen habe:
„Die Methode hat das Potenzial, zur Konstruktion viraler, mikrobieller oder eukaryotischer Genome mit einer Länge von mehreren Millionen Basenpaaren genutzt zu werden und Restriktionsstellen an beliebigen Nukleotiden in einem mikrobiellen Genom einzufügen.“
Der Zeitpunkt der Veröffentlichung ist bedeutsam, da die Arbeit genau zu dem historischen Zeitpunkt erschien, als die Welt in die Ära der modernen Coronavirus-Ausbrüche eintrat.
Praktisch beschrieb die Arbeit ein System, das es Wissenschaftlern ermöglichte, Coronaviren am Computer und im Labor zu konstruieren und zu modifizieren, schnell testbare Virusmodelle zu erstellen und zu untersuchen, wie sich bestimmte genetische Veränderungen auf das Virus auswirkten.
Diese Fähigkeiten waren wichtig für die Entwicklung von PCR-Tests, die Impfstoffforschung, die Virusverfolgung und groß angelegte Programme zur Pandemiebekämpfung nach dem Auftreten von SARS.
Das Manuskript ging ursprünglich am 31. Januar 2002 bei der Zeitschrift ein, wurde am 22. Juli 2002 angenommen und schließlich in der Novemberausgabe 2002 des Journal of Virology veröffentlicht.
Im selben Monat gaben chinesische Behörden später bekannt, dass die ersten SARS-CoV-1-Fälle in der Provinz Guangdong auftraten – ein Ausbruch, der die weltweiten Investitionen in die Sequenzierung von Coronaviren, die reversen Genetik, die PCR-Diagnostik, die genomische Überwachung, die synthetische Biologie, Impfstoffplattformen und die Forschungsinfrastruktur zur Pandemiebekämpfung für die nächsten zwei Jahrzehnte dramatisch beschleunigen sollte.
Jahre später sollte Baric skizzieren und patentieren, wie Coronaviren mit den charakteristischen Merkmalen von SARS-CoV-2 konstruiert werden können – eine Insertion einer Furin-Spaltstelle (PRRA) an der S1/S2-Verbindungsstelle, gezielte, auf den Menschen optimierte Mutationen im gesamten Rezeptorbindungsbereich (einschließlich des kritischen Rests Q498) sowie die Substitution durch zwei Proline (V1060P/L1061P) zur Stabilisierung des Spike-Proteins in seiner Präfusionskonformation – nur wenige Monate vor Beginn der COVID-19-Pandemie.
